Kliničke informacije

Važnost fetalne frakcije

Što je slobodna DNA?

 

Slobodna (eng. cf ili cell free) DNA naziv je za kratke, fragmentirane molekule DNA koje se oslobađaju u krvnu plazmu uslijed apoptoze (programirane stanične smrti). Majčina slobodna DNA potječe iz razgrađenih masnih stanica i leukocita, a fetalna slobodna DNA potječe iz razgrađenih stanica placente. Krvna plazma trudnice sadržava slobodnu DNA koja je kako majčinskog tako i fetalnog podrijetla. Znatno je manja količina fetalne slobodne DNA u odnosu na majčinu slobodnu DNA (cca 10% fetalne, cca 90% majčine cfDNA).

 

Obje se komponente analiziraju tijekom neinvazivnog prenatalnog testiranja (NIPT), ali za otkrivanje kromosomskih poremećaja fetusa nužna je analiza dovoljne količine slobodne DNA fetusa.

 

Što je fetalna frakcija?

 

Fetalna frakcija je postotak slobodne (cf) DNA koja je fetalnog porijekla, odnosno koja je porijeklom iz placentalnog trofoblasta. Stoga se analiza slobodne DNA (NIPT) može smatrati tekućom biopsijom placente.

Što je slobodna DNA?

Zašto je fetalna frakcija važna?

 

Fetalna frakcija (FF) jedan je od najvažnijih parametara koji utječe na točnost testiranja jer ispod potrebnog minimuma FF opada točnost NIPT rezultata. Pojedine metode NIPT-a imaju različite vrijednosti minimuma fetalne frakcije, ispod koje detektiranje kromosomopatija više nije precizno što može dovesti do lažnih rezultata testa.

 

Svi neinvazivni prenatalni testovi (NIPT) na tržištu provode se tzv. next generation tehnologijom, ali koriste dva različita pristupa, odnosno dvije metode koje imaju različite minimume fetalne frakcije;

 

A) metoda prebrojavanja (masovno paralelno shotgun sekvenciranje – MPS i mikročip -eng. microarray) – metoda koju koristi većina testova na tržištu i kojoj se točnost smanjuje ispod minimuma FF od 8%

B) SNP – metoda novije generacije kojoj se točnost smanjuje ispod minimuma FF od 2,8%

 

Više o pojedinoj metodi možete pročitati u daljnjem tekstu.

Koji biološki čimbenici utječu na fetalnu frakciju?

 

Fetalna frakcija između 9. i 14. tjedna trudnoće varira od ~2% do ~20% . Na njen postotak utječe više čimbenika, prvenstveno gestacijska dob trudnice i težina trudnice, ali i veličina placente te jeli trudnoća jednoplodna ili višeplodna. Također na fetalnu frakciju utječe i tip aneuploidije.

 

Trudnoće sa sindromom Down imaju višu fetalnu frakciju od prosjeka, dok trudnoće s trisomijama 18 (Edwardsonov sindrom) i 13 (Patauov sindrom) imaju nižu fetalnu frakciju od očekivanog prosjeka. Fetalna frakcija također varira ovisno radi li se o trudnoći s materalnom ili parentalnom triploidijom.

 

Uzimanje antikoagulantne terapije može utjecati na smanjenje fetalne frakcije i povećati rizik za lažne rezultate kod NIPT-ova koji koriste metodu prebrojavanja (eng counting) te se tada NIPT-ovi koji koriste tu metodu ne preporučuju. Radi svoje mogućnosti razlikovanja DNA fetusa (cff) od majčinog DNA (cf) preporučuje se SNP metoda čija preciznost ne ovisi o postotku fetalne frakcije.

Fetalna frakcija je jedan od najvažnijih parametara koji utječe na točnost testiranja jer ispod njenog potrebnog minimuma za testiranje opada i točnost testa što povećava mogućnost lažnih rezultata.

Metode na kojima počiva NIPT

Niti jedna NIPT metoda ne može iz majčine krvi fizički izdvojiti samo fetalnu DNK koja bi se onda analizirala.

Upravo način kojim NIPT očitava podatke iz fetalne DNK je ono po čemu se NIPT-ovi razlikuju.

A) Metoda prebrojavanja

 

1. Masovno paralelno shotgun sekvenciranje (MPSS)

NIPT-ovi na tržištu uglavnom koriste ovu metodu. Masivno u nazivu odnosi se na veliku količinu DNA podataka, paralelno znači da se mnogi fragmenti DNK sekvenciraju istovremeno, a “shotgun” da se sekvencira nasumice.

 

Masivno paralelno sekvenciranje temelji se na usporedbi ukupne slobodne DNK (majčina + fetalna) s referentnim genomom. Masovno znači da se nakon ekstrakcije i amplifikacije čitave slobodne DNK iz majčine plazme izvodi paralelno sekvenciranje (S-MPS); na čijem temelju se vrši prebrojavanje  velikog broja fragmenata DNK u plazmi, dodijelivši im njihov kromosom podrijetla. Pomoću ove metode dokaz aneuploidije je očit kada postoji relativni višak (što nazivamo trisomija) ili deficit (što nazivamo monosomija) u bilo kojem promatranom kromosomu u odnosu na njihov očekivani broj.

 

Npr. U testiranju na sindrom Down izuzima se uzorak krvi u kojem se nalazi slobodna DNK trudnice i slobodna DNK fetusa. U krvi trudnice čiji fetus ima sindrom Down, nalazi se slobodna DNK fetusa s extra kromatidom kromosoma 21. Ovom metodom slobodne DNK trudnice i fetusa ne mogu se pojedinačno gledati već se promatraju kao jedna cjelina. Njihov zbroj se umnaža i uspoređuje s očekivanim relativnim omjerom.

 

Taj način za procjenu aneulopidija ima određena ograničenja; za analizu se uzimaju cijele slobodne DNK iz plazme koje su većinom majčine, te sama točnost za procjenu prisutnosti aneuploidija uvelike ovisi o količini prisutne slobodne fetalne DNK i prisutnosti ostalih fragmenata slobodne DNK (adipociti, vanishing twin, tumorska DNK, transplatacija koštane srži…).

Ako fetalne slobodne DNK ima malo u odnosu na majčinu slobodnu DNK, onda je mogući poremećaj u broju fetalnih kromosoma teže uočiti; što je manje slobodne fetalne DNK, teže se uočava poremećaj fetalnih kromosoma.

 

Već ispod 8% fetalne frakcije opada “vidljivost” te se na 4% ne prepoznaje više od trećine mogućih poremećaja (38%) što znači da u 38% slučajeva test može dati lažni rezultat. Pri niskim fetalnim frakcijama rezultati analize zapravo se odnose na slobodnu majčinu, umjesto na slobodnu fetalnu DNK. Upravo zbog promatranja slobodne DNA majke i fetusa kao jedne cjeline, osjetljivost ovakve analize opada ispod 8% fetalne frakcije i na 4% joj je osjetljivost 62%. Ako se prisjetimo da udio fetalnog dijela DNK između 9. i 14. tjedna trudnoće, kada se testovi najčešće provode, varira od ~2% do ~20%, postoji velika šansa da će u ranijoj trudnoći ova metoda testiranja imati i manju osjetljivost pogotovo za trisomiju 18 (Edwardsonov sindrom) i 13 (Patauov sindrom).

2. Mikročip

Mikročip metoda je starija i najjeftinija metoda određivanja s novim DANSR algoritmom. Kao metoda prebrojavanja, mikročip se također temelji na usporedbi ukupne slobodne DNK (majčina + fetalna), ali  s referentnim kromosomom. Slobodna DNA iz uzorka krvi majke analizira se korištenjem multipleks proba – ta analiza nazvana je digitalna analiza ciljanih regija (DANSR).

 

Kod ove metode promatra se zbroj slobodne DNK trudnice i fetusa usporedo s nekim kromosom za kojeg se pretpostavlja da je stabilan (npr. kromosom 3). Budući da je poznato koliko je kromosom 3 (214Mb) veći od kromosoma 21 (47Mb) promjena u izmjerenom omjeru ukazuje na povećan rizik za sindrom Down.

Budući da mikročip kao metoda prebrojavanja ne razlikuje fetalnu od ukupne slobodne DNK te trudničin i fetalni dio promatra zajedno zbrojene, prepoznaje samo promjene u količini DNK, ali ne i odakle nastaju te promjene, odnosno jesu li kromosomi majke promijenjeni. Stoga se mikročipom ne može pouzdano detektirati monosomija, a uopće ne može prepoznati triploidija.

 

Za razliku od MPS-a, mikročip metoda promatra samo unaprijed određena mjesta, ne cijeli genom, manji je broj čitanja, stoga jeftinije i brže dolazi do rezultata. Kao i MPS ovisna je o postotku fetalne frakcije, te joj točnost rezultata opada već ispod 8% fetalne frakcije.

B) SNP metoda

Jednonukleotidni polimorfizmi, koji se nazivaju SNP-ovi (izgovaraju se „snip“), najčešći su tip genetske varijacije među ljudima. U genomu osobe postoji otprilike 4 do 5 milijuna SNP-ova. Te varijacije jedinstvene su za svaku osobu te je pomoću njih lako razlikovati DNK različitih osoba.

 

SNP metodom (eng. single nucleotide polymorphism) ciljano se sekvenciraju polimorfne regije (promjene jednog nukleotida), pritom određujući koji se SNP-ovi odnose na trudnicu, a koji na fetus.

 

SNP metoda jedina razlikuje majčinu od fetalne slobodne DNK što omogućuje uspostavljanje SNP profila samo za majku.

 

Za razliku od metode prebrojavanja (MPS i mikročip), SNP metoda se temelji na usporedbi konkretnih genotipova dobivenih analizom specifičnih DNA biljega (SNP); genotipa trudnice i genotipa fetusa. Dakle, ova metoda testiranja jedina razlikuje koji se podatci odnose na majčinu, a koji na fetalnu slobodnu DNA. Ovakav pristup rezultira manjim brojem lažno pozitivnih i lažno negativnih rezultata naspram ostalih metoda.

SNP metoda

Svi testovi na tržištu koriste jednu od dvije osnovne metode, a razlikuje ih jedino algoritam koji koriste za izračun podataka. Metoda i algoritam utječu na točnost samog testa.

Validacijske studije

Rizik za aneuploidije i triploidiju, odnosno za poremećaj broja kromosoma u zametku raste sa starošću trudnice.

 

Nakon 36. godine preporuka je da se svaka trudnica testira nekim prenatalnim testom. Zbog velike osjetljivosti NIPT-ova znatno je smanjeno izvođenje invazivnih zahvata, a veliki broj napravljenih testova (NIPT) omogućio je izradu znanstvenih studija koje su istražile njihove mogućnosti i specifikacije.

Znanstvene studije većine prenatalnih testova rađene su na trudnicama starijima od 36. godina te njihove specifikacije ne vrijede za mlađe trudnice upravo stoga jer je rizik za aneuploidije i triploidiju manji.

 

Takve znanstvene studije koje se još nazivaju validacijske studije važne su za prepoznavanje kvaliteta pojedinog NIPT-a i sigurnost preporučivanja istog.

Prilikom odabira testa, poželjno je provjeriti na koje sve aneuploidije je test validiran kao i koliko je znanstvenih studija napravljeno za test, što nam daje sigurnost u točnost testa.

Većina testova je validirana jedino za trisomije 21, 18 i 13 dok to nije slučaj i za mikrodelecije koje testiraju

Uzorci lažnih rezultata

Uzroci lažno pozitivnog rezultata:

 

  • Neprepoznati iščežujući blizanac
  • Placentalni mozaicizam
  • Mozaicizam spolnih kromosoma trudnice
  • CNV – varijacije broja kopija kod trudnice
  • Mogući tumori trudnice
  • Transplantacija
  • Nedostatak validacijske studije

Uzroci lažno negativnog rezultata:

 

  • Niska fetalna frakcija
  • Triploidija
  • Potpuna molarna trudnoća
  • Placentalni mozaicizam
  • CNV – varijacije broja kopija kod trudnice
  • Blizanačka trudnoća
  • Nedostatak validacijske studije

Mogućnosti SNP metode

Fetalna frakcija

NIPT koji koristi SNP metodu zadržava jednaku točnost pri visokoj i niskoj fetalnoj frakciji.

 

Zbog svoje sposobnosti da analizira slobodnu fetalnu DNA kao zasebni genotip, točnost pri otkrivanju trisomija ne smanjuje se čak i ako je fetalna frakcija od 2,8% do 8%. S obzirom da približno 1 od 3 komercijalna uzorka krvi ima fetalnu frakciju manju od 8%, ovo je razlikovanje metoda NIPT-ova važno.

 

Zbog promatranja slobodne DNA majke i fetusa kao jedne cjeline, osjetljivost metode prebrojavanja opada ispod 8% fetalne frakcije i na 4% joj je osjetljivost 62%,[1]  za razliku od SNP metode koja već pri 2,8% FF zadržava osjetljivost od 99,99%, što omogućuje ranu analizu, već od 9. tjedna trudnoće.

Mogućnost SNP metode - Fetalna frakcija

Išćežujući blizanac

 

Iako slobodna DNK fetusa uglavnom nestaje u roku od 2 sata nakon porođaja, ako fetus ostane u maternici zbog ko-blizanske smrti, dolazi do apoptoze placente koja oslobađa slobodnu DNK iz nestalog blizanca u majčinu cirkulaciju. Čak i do 10 tjedana nakon smrti, DNK išćežujućeg blizanca može se detektirati i potencijalno dovesti do lažno pozitivnih rezultata kod metode prebrojavanja. Sa SNP metodom može se otkriti mogući isčežujući blizanac, što bi upozorilo liječnika na detaljnije promatranje ultrazvukom, ali se neće moći dobiti nalaz za prisutnost kromosomopatija.

 

Prisutnost isčežujućeg blizanca jedan je od glavnih uzroka lažno pozitivnih rezultata s obzirom na to da je za isčežujućeg blizanca vjerojatnije da ima kromosomske abnormalnost. Studije su pokazale da je više od 15% lažno pozitivnih rezultata bilo povezano s prisutnošću iščežujućeg blizanca.[2] [3] [4] SNP metoda je jedina metoda koja može detektirati ovaj dodatni haplotip i tako spriječiti lažno pozitivno stanje. Ako je ultrazvukom prepoznat iščežujući blizanac NIPT se ne preporuča.

Triploidija

 

Većina kliničkih NIPT metoda koristi se prebrojavanjem koji se oslanja na usporedbi apsolutnog broja očitanih sekvenci iz kromosoma koji su od interesa s referentnim kromosomima iz istog zbroja, a fetalna trisomija se zaključuje kada taj omjer premaši prethodno zadani prag. Budući da su svi kromosomi u triploidnim fetusima trisomski, omjer je identičan kao u euploidnih fetusa; uspoređivanje s referentnim kromosom iz istog zbroja ovoj metodi onemogućuje otkrivanje triploidije.

 

Metoda prebrojavanja ne može odrediti kome pripada DNK (fetusu ili trudnici) i stoga nije u stanju otkriti dodatne fetalne haplotipe povezane s triploidijom ili išćežujućim blizancem. Dok ostale metode slobodnu DNK majke i fetusa uspoređuju sa svojim zbrojem, SNP metoda ciljano promatra slobodnu DNK fetusa i uspoređuje je s majčinom te pouzdano prepoznaje dodatni set kromosoma.

Triplodija

Potpuna molarna trudnoća

 

U 90% slučajeva kompletne mole nalazi se kariotip 46 XX isključivo paternalnog porijekla. Otuda zaključak da je kompletna mola isključivo androgenetičkog porijekla. Citogenetske analize pokazuju da se ovdje zapravo radi o vrlo ranoj eliminaciji proneuklusa majčinog podrijetla i do dupliciranja proneuklusa očevog podrijetla. Dupliciranje haploidnog kromosomskog seta s X kromosomom paternalnog podrijetla smatra se načinom nastanka većine kompletnih molarnih trudnoća.

 

Svega 8% – 9% kompletnih molarnih trudnoća posjeduje kariotip 46XY. U ovim slučajevima se radi o fertilizaciji prazne jajne stanice s dva spermija (dispermija): jednim spermijem s Y kromosomom i jednim spermijem s X kromosom. Takva jajna stanica obično odumire sama po sebi, no u 1-2% svih trudnoća, razvija se i stvara molarnu trudnoću. Zbog nedostatka majčine DNK, ne dolazi do razvoja fetusa, ali se množe stanice buduće posteljice. Takvo stanje naziva se kompletna mola.

 

Za razliku od metode prebrojavnja, SNP metoda prepoznaje nedostatak majčine DNK.

Majčin mozaicizam za X0 (mozaicizam spolnih kromosoma)

 

Mogućnost razlikovanja slobodne fetalne DNK od majčine osobito je važna za stanja poput monosomije X, kada je važno utvrditi majčin mozaicizam za XO. Kako žena stari, drugi X-kromosom može se izgubiti iz nekih stanica.[5] Međutim, kod metode prebrojavanja, ovaj normalan biološki fenomen može dovesti do lažno pozitivnog otkrivanja fetalne monosomije X u NIPT-u, kada je fetus zapravo normalan.

 

Bez odvojene analize majčinog DNA, metodom prebrojavanja se ne može otkriti fetalna spolna anomalija. SNP metoda analizira specifičan doprinos majčinog DNA koji smanjuje stopu lažno pozitivnih rezultata vezanih uz majčin mozaicizam (XCL) i varijante broja kopija (CNV).

Placentalni mozaicizam

 

Pogrešna raspodjela kromosoma prilikom podjele stanica u post-zigotičnoj fazi može rezultirati mozaikom s dvije ili više staničnih linija koje imaju različitu raspodjelu kromosoma. Utjecaj mozaicizma na fenotip ovisi o uključenim kromosomima i njihovoj distribuciji među tkivima te u kojem stadiju razvoja je došlo do pogrešne raspodjele. Kada se pogrešna raspodjela kromosoma dogodi u blastocisti, odnosno prije diferenecijacije tkiva u tkivo fetusa i tkivo koriona, mozaicizam će biti prisutan u placenti i fetusu. Ako se dogodi kasnije, mozaicizam će biti prisutan u placenti ili u fetusu, ali nikad u oba.

 

Mozaicizam je uglavnom prisutan u placenti, jer je potreban veći broj mitotičkih podjela u tkivima koja se razvijaju ekstrafetalno u usporedbi s tkivima fetusa tijekom ranog razvoja. Teoretski, mitotička greška u ranim fazama razvoja vjerojatnije će se pojaviti u placenti nego u fetalnoj staničnoj liniji.

 

Vjerojatnost da je mozaicizmom zahvaćena placenta i fetus također ovisi i o nastaloj aneuploidiji.

 

Ako se u placenti indetificira trisomija 13, vjerojatnost da je zahvaćen fetus je 2,4% . Trisomija 21 pokazuje najveću vjerojatnost da je zahvaćen i fetus od 34%. Međutim, kod trisomije 21, ako su mozaikom zahvaćena oba sloja placenta, vjerojatnost da je fetus zahvaćen raste na 100%.[1]

 

Odstupanja između korionskih resica (placente) i fetusa pronađena su na samom početku upotrebe biopsije korionski resica (CVS-a), metode za kariotipizaciju fetusa u prvom tromjesečju.

 

Svi NIPT-ovi u testiranju na kromosomske poremećaje fetusa koriste slobodnu DNK placente te je svaki visok rizik potrebno potvrditi amniocentezom.

Donirana jajna stanica

 

Donirana jajna stanica ključna je u tretmanu potpomognute oplodnje gdje žena donira jajašce kako bi drugoj ženi omogućila začeće. U svrhu potpomognute reprodukcije, doniranje jajne stanice obično uključuje tehnologiju in vitro oplodnje (IVFeng. In-Vitro-Fertilisation), pri čemu se jajašca oplođuju u laboratoriju; rjeđe se nefertilirana jaja zamrznu i pohrane za kasniju upotrebu.

 

Zbog svoje mogućnosti razlikovanja slobodne DNK trudnice i fetusa, SNP metoda prepoznati će slobodnu DNA donirane jajne stanice i analizirati na aneuplodije s osjetljivošću od 99,99%.

Tumori

 

Budući da gotovo svi tumori imaju somatske genetske promjene koje se mogu odražavati u cirkulaciji cfDNA,[7] [8] a mnogi od tih poremećaja uključuju kromosome 21, 18 i 13 (fokus NIPT-a),[9] vjerovatno je da bi se neskladni NIPT-rezultati mogli objasniti prisutnošću malignih bolesti majke, posebno ako rezultati NIPT-a pokazuju više aneuploidija. U nedavnom istraživanje na više od 4000 trudnica koje su bile podvrgnute NIPT-u, u tri pacijentice pronađene su abnormalnosti genoma koje podsjećaju na varijaciju broja kopija (CNV) povezanih s tumorima.[10]

 

Metode prebrojavanja dati će lažno pozitive rezultate, odnosno pokazat će visok rizik za aneuploidije i onda kada je genotip fetusa normalan, ako trudnica ima dodatne gene uzrokovane tumorom.

 

SNP metoda jedina je metoda koja utvrđuje poremećaje broja kromosoma uzrokovane majčinim dodatnim genima uzrokovanim tumorima time izbjegavajući lažne rezultate.

Transplantacija

 

SNP metoda s visokom preciznošću može razlikovati porijeklo slobodne DNK i utvrditi koji DNK pripada trudnici, a koji donoru organa.

 

Razlikovanje SNP-ova pojedine osobe omogućilo je razvitak neinvazivnog testa za procjenu odbijanja transplantiranih organa. Tom tehnologijom iz krvi primatelja mjeri se količina slobodne DNK nastale uslijed aktivnog odbijanja doniranog organa.[11] Utvrđivanjem slobodne DNK donora i slobodne DNK majke, NIPT koji koristi SNP metodu fokusira se samo na DNK fetusa i time izbjegava lažne rezulatate.

Blizanačka trudnoća

 

Blizanačka trudnoća od samog pojavljivanja NIPT-ova na tržištu je predstavljala izazov za analizu. Pojedini testovi su u ponudi imali i testiranje blizanačke trudnoće iako tehnički nisu testirali na aneuploidije pojedinog blizanca. Ono što se testira je ukupna slobodna fetalna DNA oba blizanca bilo metodom prebrojavanja ili mikročip metodom gdje je stopa detekcije dosta manja nego kod jednoplodnih trudnoća. Navedene dvije metode ne mogu dati odgovor kolika je fetalna frakcija pojedinog blizanca.

 

Kao primjer možemo navesti blizanačku trudnoću gdje je ukupna fetalna frakcija 10% što je iznad minimuma koji test zahtjeva za svoju potvrđenu točnost. Metoda prebrojavanja i mikročip metoda ne mogu odrediti koliku fetalnu frakciju ima pojedini blizanac. Jedan od blizanaca može imati FF 7%, dok  drugi ima FF 3% od navedenih FF 10%. To znači da će metoda prebrojavanja analizirati slobodnu DNK samo jednog blizanca dok će drugom DNK biti ispod potrebnog minimuma, nedohvatljiva za analizu. U tom slučaju rezultati će biti izdani iako je bila analizirana slobodna DNK samo jednog blizanca što povećava mogućnost javljanja lažnih rezultata.

 

SNP metoda jedina se odlikuje mogućnošću razlikovanja fetalne frakcije i spola svakog od blizanaca kod blizanačkih trudnoća jer prepoznaje i razlikuje slobodnu DNK oba fetusa. Za svakog blizanca izdaje se individualna fetalna frakcija koja se ciljano analizira što povećava stopu otkrivanja aneuploidija kod blizanaca. Ako je kod SNP metode vrijednost fetalne frakcije jednog blizanca manja od minimuma potrebnog za analizu, nalaz se ne izdaje i trudnici se nudi savjetovanje i ponavljanje izuzimanja krvi u skladu s njenim rezultatima testa i općem stanju trudnoće.

 

Prepoznajući radi li se o jednom ili dva DNK fetusa otkriva se i korionicitet čime se može potaknuti ranija, ciljana procjena komplikacija povezanih sa sindromom međublizanačke transfuzije (TTTS) u monokorijalnim trudnoćama.

Mikrodelecije

 

NIPT također može uključivati i probir za dodatne kromosomske poremećaje koji su uzrokovani nedostajućim (delecije) djelovima kromosoma.

 

Sindromi kromosomskih mikrodelecija nastaju zbog gubitka dijelova kromosoma manjih od 5Mb. Klinički važne mikrodelecije učestalije su nego što se prije mislilo te mogu biti prisutne i kada ultrazvučno nisu pronađene anomalije. Ukupna pojavnost pet najučestalijih delecija je 1:1000. Ovisno o tome koji geni nedostaju, nastaju pojedini mikrodelecijski sindromi sa svojim specifičnim malformacijama i simptomima. Zato što se radi o tako malom, ali značajnom nedostatku genetičkog materijala, važno je precizno dohvatiti nedostatak pojedinih gena. Kod odabira testa koji analizira i mikrodelecije, jako je važno provjeriti vjerojatnost detekcije odabranog testa za pojedine mikrodelecije prema njihovoj veličini (Mb). Budući da je većina mikrodelecija manja od 5 Mb validiranost testa za analizirane mikrodelecije potvrđuje realnu mogućnost testa da navedene mikrodelecije detektira. Npr. metoda masivno paralelnog sekvenciranja koju koriste većina NIPT-ova na tržištu nije validirana za mikrodelecije manje od 10Mb.

Mikrodelecije

 

SNP metodom, radi visoke specifičnosti, moguće je precizno prepoznavanje sindroma nastalih uslijed mikrodelecija koje NIPT analizira.

 

DiGeorgeov sindrom tip 1 koji se još naziva i 22q11.2 delecijski sindrom, jedan je od najčešćih razvojnih poremećaja i kongenitalnih bolesti srca, sa samo nešto manjom pojavnošću od sindroma Down. Radi se o jednoj od najmanjih mikrodelecija (1,5-3 Mb) koju je teško prepoznati drugim metodoma. SNP metodom može se s velikom osjetljivošću prepoznati da taj dio kromosoma fali, što je važno radi prevencije komplikacija vezanih uz taj sindrom.

Validacijska studija na trudnicama mlađima od 36. godina

 

Rezultati studije provedene na metodi temeljenoj na SNP-u i pratećoj informatici pokazali su visoku osjetljivost i specifičnost u otkrivanju fetalnih trisomija 21, 18 i 13, monosomije X te spola fetusa kod trudnica visokog rizika i niskog rizika, odnosno kod trudnica starijih i mlađih od 36 godina.[12]

 

Usporedba ove metode temeljene na SNP-u s metodom prebrojavanja (“counting”) pokazala je značajno poboljšanje performansi.

 

SNP metoda je jedina metoda validirana za trudnice iznad i ispod 36 godina, pružajući ginekologu sigurnost prilikom preporuke NIPT-a temeljenom na SNP metodi.

Zaključak

Poznati uzroci lažno pozitivnih rezultata u NIPT-u su isčežujući blizanac, majčine kromosomske nepravilnosti (posebno mozaicizam spolnog kromosoma), ograničeni mozaicizam posteljice, CNV, transplantacija, nedostatak validacijske studije. Uzrok lažno negativnih rezultata je niska fetalna frakcija, triploidija, potpuna molarna trudnoća, nedostatak validacijske studije. Analizom DNA bez razlikovanja majčine od fetalne DNA kao što je metoda prebrojavanja ne može se otkriti triploidija, isčežujući blizanac, mozaicizam majke, potpuna molarna trudnoća, dodatni genetski sadržaj uzrokovan tumorom i transplantacijom. Samo NIPT utemeljen na SNP-u može otkriti iščežujućeg blizanca i majčine nepravilnosti. Budući da je NIPT na bazi SNP-a manje ovisan o postotku fetalne frakcije i u mogućnosti prepoznati pojedine DNK, ima nižu stopu lažno negativnih i lažno pozitivnih rezultata u usporedbi s metodom prebrojavanja.

 

NIPT metode temeljene na cffDNA još uvijek nisu u stanju prepoznati placentalni mozaicizam, djelomične trisomije ili translokacije.

Ukoliko imate dodatna pitanja na koja bi htjeli odgovor, pišite nam na email:

REFERENCE

    1. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25315809  A unified approach to risk assessment for fetal aneuploidies. Wright D1, Wright ANicolaides KH.
    2. Futch T, Spinosa J, Bhatt S, Feo E, Rava RP, Sehnert AJ. Initial clinical laboratory experience in noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy from maternal plasma DNA samples. Prenat Diagn. 2013;33:569‐574. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
    3. Nicolaides KH, Syngelaki A, Ashoor G, Birdir C, Touzet G. Noninvasive prenatal testing for fetal trisomies in a routinely screened first‐trimester population. Am J Obstet Gynecol. 2012;207(374):e1‐e74. e6. [PubMed] [Google Scholar]
    4. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert‐Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med. 2011;13:913. [PubMed] [Google Scholar]
    5. X chromosome loss and ageing. Russell LM1, Strike PBrowne CEJacobs PA
    6. https://obgyn.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/uog.15975
    7. Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA, Jr, Kinzler KW. Cancer genome landscapes. Science. 2013;339(6127):1546–1558. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
    8. Bettegowda C, Sausen M, Leary RJ, et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci Transl Med. 2014;6(224):224ra24. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
    9. Duijf PH, Schultz N, Benezra R. Cancer cells preferentially lose small chromosomes. Int J Cancer. 2013;132(10):2316–2326. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar]
    10. Amant F, Verheecke M, Wlodarska I, et al. Presymptomatic identification of cancers in pregnant women during noninvasive prenatal testing. JAMA Oncol. doi: 10.1001/jamaoncol. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
    11. Sigdel TK, Archila FA, Constantin T, et al. Optimizing Detection of Kidney Transplant Injury by Assessment of Donor-Derived Cell-Free DNA via Massively Multiplex PCR. J Clin Med. 2019;8(1):19.
    12. https://journals.lww.com/greenjournal/Fulltext/2014/08000/Single_Nucleotide_Polymorphism_Based_Noninvasive.3.aspx